蛋白互作在细胞生命活动中起着关键作用，在不同时空层面上参与多种细胞过程，例如，调控细胞周期、蛋白质的合成与分泌、信号转导与代谢等。因此了解与研究蛋白质间的相互作用，是理解细胞内发生若干生物化学活动的第一步。在植物中研究蛋白互作时，大家常用的方法有：双分子荧光互补实验（bifc荧光素酶互补实验（lca以及免疫共沉淀（co-ip等，那么除了这些常用的技术之外，还有其它的蛋白互作研究方法吗？答案当然是肯定的！在本期的推文中，小远就和大家一起来盘点一下在植物中研究蛋白互作的方法都有哪些吧！
本篇文章速览：
双分子荧光互补（bifc
双分子荧光互补（bimolecular fluorescence complementation, bifc）技术是基于蛋白质互补技术发展起来的，能够用于检测植物体内的蛋白质相互作用。其原理是将荧光蛋白拆分成可独立折叠的n端和c端两个亚基，并分别与两个待研究的目标蛋白融合表达。如果这两个目标蛋白具有相互作用的关系，就会把两个亚基拉近，从而促使两个亚基组装成完整功能的荧光蛋白，并通过荧光蛋白发光指示来表征蛋白质相互作用的发生以及相互作用的位置（图1）。
图1 双分子荧光互补验证蛋白互作的原理图。（*伯远生物科研绘图团队）
应用案例2023年8月，shang等人在plant biotechnology journal杂志上发表了题为“a fungal cfem-containing effector targets npr1 regulator nimin2 to suppress plant immunity”的研究**，在该**中，作者为了**cfec12的互作蛋白，先用酵母双杂筛库鉴定出了11个候选蛋白，接着通过点对点验证，证实了只有全长的mdnimin2（细胞核中npr1的调节因子）与cfec12具有强烈的相互作用。为了进一步验证cfec12和mdnimin2的互作，作者利用bifc实验，分别构建了cfce12-nyfp和mdnimin2-cyfp载体，通过共转烟草，在烟草的表皮细胞核中观察到了荧光信号，这一结果证实了cfec12和mdnimin2可以相互作用。最后，作者还通过co-ip实验再次验证了cfce12和mdnimin2蛋白的相互作用（图2）。
图2 cfec12靶向苹果mdnimin2蛋白(shang et al., 2023)。作者利用三种方法综合解析了cfec12和mdnimin2的相互作用：（a）酵母双杂证实cfec12和mdnimin2在酵母中互作；（b）bifc证实cfec12与mdnimin2在植物细胞核中互作；（c）co-ip进一步证实cfec12与mdnimin2在植物体内互作。
荧光素酶互补实验（lca
荧光素酶互补实验（luci-ferase complementation assay, lca）以萤光素为底物来检测萤光素酶的活性，其实验原理是将萤光素酶蛋白拆分为n端和c端2个功能片段，即nluc和cluc。在一个实验体系中，将待检测的2个目标蛋白分别与nluc和cluc融合，如果2个目标蛋白相互作用，则萤光素酶的nluc和cluc在空间上会足够靠近并正确组装，从而发挥萤光素酶活性，即分解底物产生荧光。该方法也是在植物中研究蛋白互作的经典方法。
图3 荧光素酶互补验证蛋白互作的原理图。（*伯远生物科研绘图团队）
应用案例2023年1月，liu等人在plant physiology杂志上发表了题为“mderf114 enhances the resistance of apple roots to fusarium solani by regulating the transcription of mdprx63”的研究**。在该**中，作者为了**在腐皮镰孢菌（fusarium solani）侵染下的mderf114调控机制。首先通过酵母双杂筛库找到了mderf114的互作蛋白mdmyb8，并结合酵母双杂点对点实验对筛选结果进行了验证。接下来，作者利用lca进一步验证了mderf114和mdmyb8的互作，结果显示只有在mderf114-nluc和mdmyb8-cluc同时存在时，烟草叶片才能观察到荧光信号。最后，作者还用bifc和pull-down两种方法证实了mderf114和mdmyb8确实存在互作（图4）。
图4 mdmyb8与mderf114相互作用(liu et al., 2023)。作者利用四种实验方法综合解析了mdmyb8与mderf114的相互作用：（a）酵母双杂；（b）lca；（c）bifc；（d）pull-down。
免疫共沉淀（co-ip
免疫共沉淀（co-immunoprecipitation, co-ip）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是使用靶蛋白特异性抗体间接捕获与特定靶蛋白结合的蛋白来鉴定体内相关的蛋白-蛋白相互作用（图5）。特异性抗体捕获样品中的靶蛋白，形成抗体-靶蛋白复合物，然后利用能够与抗体结合的珠状支持物（例如nanoab-agarose）来固定和沉淀复合物，与靶蛋白相互作用的蛋白也会同时被沉淀下来，最后洗去与靶蛋白相结合的非特异性蛋白，再通过sds-page进行分析、western blot检测得到我们要验证的结果。除了用于测定两种目标蛋白是否在植物体内互作外，co-ip也可以与质谱（ms）联用来研究与特定蛋白互作的未知蛋白。有关co-ip更加详细的介绍，大家可以查阅小远的往期文章“co-ip—验证蛋白互作的不二之选”。
图5 co-ip结合原理图。（*伯远生物科研绘图团队）
应用案例2023年10月，gao等人在cell杂志上发表了题为“ca2+ sensor-mediated ros sc**enging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector”的研究**，在该**中，作者为了阐明rod1介导的免疫抑制的分子机制，首先以rod1为诱饵，利用酵母双杂交筛选出了可能与rod1相互作用的蛋白。然后利用co-ip验证了rod1与两个e3泛素连接酶apip6、rip1的互作关系。co-ip结果显示，apip6和rip1均可以把rod1蛋白共沉淀下来（图6）。说明rod1蛋白可以与apip6或rip1蛋白存在相互作用。
图6 通过免疫共沉淀（co-ip）检测本氏烟叶片中rod1与rip1和apip6的相互作用(gao et al., 2021)。由于全长rip1和apip6蛋白在植物中的不稳定性，因此使用缺少ring结构域的截短版本进行相互作用测定。
邻近标记技术（pl
邻近标记（proximity labeling, pl）技术是将一个具有特定催化连接活性的工具酶与目的蛋白融合，通过添加小分子底物（如生物素（biotin）），在工具酶的催化作用下小分子底物被活化并共价连接到酶邻近的内源蛋白上，被标记的蛋白经富集后进行质谱分析，可鉴定与目的蛋白互作或邻近的蛋白信息（苏田等， 2020）。该技术可直接在自然条件下的活细胞内进行，用于捕获体内瞬时发生或微弱的蛋白互作关系，帮助科研人员更好地理解细胞内复杂的生物学过程（图7）。关于邻近标记技术常用的邻近标记酶，以及该技术在其它方面的应用，大家感兴趣的话可以查阅小远的前期文章“你会用什么方法研究蛋白的弱/瞬时相互作用？”。
图7 邻近标记技术原理示意图(yang et al., 2020)。（a）基于完整型邻近标记酶的邻近标记测定。将生物素连接酶或抗坏血酸过氧化物酶（apex酶）与目标蛋白融合并在活细胞中表达，再向培养基中添加底物，例如生物素或生物素-苯酚和过氧化氢（h2o2）后，目标蛋白质附近的蛋白或rna可以被生物素标记。通过裂解细胞并与亲和素磁珠一起孵育，可以富集被生物素标记的蛋白质或rna，用于后续的lc-ms/ms或高通量测序分析。（b）用于识别蛋白质复合物组成的拆分型邻近标记酶系统。邻近标记酶的n端和c端分别与一对已知的互作蛋白融合。当这对蛋白在细胞中相互作用时，邻近标记酶的两半被拉得很近，并重组成完整的邻近标记酶，对蛋白质复合物附近的蛋白进行标记，通过裂解细胞并与亲和素磁珠一起孵育，可以富集被生物素标记的蛋白质，用于后续的lc-ms/ms测序分析。
应用案例2023年7月，zhang等人在nature communications杂志上发表了题为“turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity”的研究**。在该研究中作者利用在本氏烟中建立起的邻近标记体系，对n蛋白介导的抗烟草花叶病毒（tmv）免疫反应中可能与n蛋白发生互作的蛋白进行了分析。将turboid融合在n蛋白的c端，同时设置citrine融合的turboid用作阴性对照。明确融合蛋白的功能及表达不受限制后，作者对存在/不存在tmv p50效应因子情况下与n蛋白相互作用的蛋白进行分析。最终在没有p50的i组样品和有p50的ii组样品中分别鉴定了3198和3262种蛋白（图8）。结合进一步分析的结果，作者最终选择了ubr7蛋白并结合bifc和gst pull-down证实了ubr7和n蛋白的互作。
图8 n nlr免疫受体的邻近和相互作用蛋白的鉴定(zhang et al., 2019)。
荧光共振能量转移荧光寿命显微成像技术（fret-flim
随着光学技术的快速发展，为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具，其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像（fret-flim）技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势。
荧光共振能量转移（förster resonance energy transfer，fret）是一种物理过程，指两个携带不同荧光基团的大分子之间或同一分子的不同荧光团之间通过电偶极相互作用所发生的非辐射能量转移（förster, 2012; margineanu et al., 2016）。其依赖于两个分子之间密切的物理相互作用，例如标记蛋白质，如果它们之间的距离小于10nm，则可以进行非辐射（偶极-偶极）能量转移(cui et al., 2019)（图9a）。传统的fret过程分析通常是基于荧光强度成像来实现，分析的结果容易受光谱串扰的影响，因而灵敏度不高。荧光寿命显微成像（fluorescence life-time imaging microscopy，flim）技术是研究细胞内生命活动状态的一种非常可靠的方法。荧光寿命是指荧光团在返回基态之前处于激发态的平均时间，是荧光团的固有性质，它能十分灵敏地反映激发态分子与周围微环境的相互作用及能量转移。将flim技术应用到fret过程分析中，利用flim技术可定量测量这一优势，可以非常灵敏地反映供体荧光分子与受体荧光分子之间的能量转移过程（图9b）。因此，利用fret-flim能够实时检测植物细胞内的蛋白互作动态。
图9 fret和fret-flim的原理图(cui et al., 2019)。（a）将具有重叠的发射光谱和激发光谱的荧光团分别与感兴趣的蛋白质融合后，当两种蛋白质发生物理相互作用时（距离<10nm），电子激发态的供体能量能被转移到基态的受体，从而可以检测到fret信号。（b）fret结合flim技术通过确定供体的荧光寿命来分析蛋白质-蛋白质相互作用。
应用案例2023年12月，xie等人在molecular plant杂志上发表了一篇题为“sh3p2, a sh3 domain-containing protein that interacts with both pib and **rpib, suppresses effector-triggered, pib-mediated immunity in rice”的研究**。在该**中，作者利用酵母双杂和fret-flim技术共同**了nlr蛋白pib与含有sh3结构域的sh3p2蛋白之间的相互作用。
为了研究pib蛋白触发对稻瘟病菌防御的机制，作者首先利用酵母双杂筛库鉴定出了多个与pib结合的候选蛋白，并结合酵母双杂点对点实验，证实了sh3p2与pib相互作用。接着，作者利用fret-flim技术进一步分析了sh3p2与pib在植物体内的相互作用。在水稻原生质体中通过flim-frit测量供体gfp-sh3p2的荧光寿命，发现供体单独表达时的平均荧光寿命为t=2.56ns，在与受体rfp-pib共表达后其荧光寿命下降至t=2.24ns，这一结果表明sh3p2在体内与pib相互作用（图10）。
图10 利用fret-flim检测pib与sh3p2蛋白之间的相互作用(xie et al., 2022)。
小远有话说
fret-flim除了可以研究两个蛋白之间的相互作用外，还可以用于研究三个蛋白之间的相互作用，有关这一部分的内容，大家可以查阅小远往期的推文“三个蛋白之间的关系如何研究？（一）”进行查看哦。
另外，将荧光素酶代替荧光蛋白质作为能量供体，开发出的生物发光共振能量转移（bioluminescence resonance energy transfer, bret）技术（图11），可以有效解决传统fret技术由于激发光导致的光毒性、光漂白等问题，不仅能降低样品背景噪音，还可提高检测灵敏度。不过，目前bret技术在动物细胞中应用的更为广泛。
图11 bret技术原理图(cui et al., 2019)。
split-halotag技术
halotag蛋白是由红球菌（rhodococcus rhodochrous）的卤代烃脱卤素酶dhaa改造而来，可以高特异性和高亲和力地与几种不同颜色的halotag荧光配基或者生物素快速形成稳定的共价结合。由于halotag配体的多样性使得halotag融合蛋白具有多种功能和较宽的光学检测范围。lang等人在2023年最先确认了halotag系统可以在植物中进行蛋白标记成像(lang et al., 2006)。随后又有研究表明halotag蛋白可以进行分离和重组，该蛋白可以在155/156aa位置处**成n端片段“nhalo”（氨基酸1-155）和c端片段“chalo”（氨基酸156-298）(ishikawa et al., 2012)。因此，研发split-halotag植物蛋白互作成像技术具备可行性。
2023年6月，minner-meinen等人在plant communications杂志上发表了题为“split-halotag imaging assay for sophisticated microscopy of protein–protein interactions in planta”的研究**。该研究建立起了检测植物体内蛋白互作的新方法split-halotag，克服了bifc存在的假阳性高、容易光漂白等缺点。在本研究中，作者利用拟南芥cnx6和cnx7亚基组成的异源四聚体钼蝶呤合酶（mpt）复合物的形成来证明植物中split‑halotag的重组。将nhalo、chalo分别与cnx7和cnx6融合在一起，由于这两个亚基的相互作用使得nhalo和chalo在空间上非常接近并重组成完整的蛋白，将cnx6-nhalo和cnx7-chalo转化到烟草表皮细胞中并用荧光配体tmr染色后，就可以观察到明显的荧光信号。此外，重组的halotag还能够结合绿色荧光配体oregon green和黄色荧光配体diacfam，并且单独表达nhalo或chalo片段时无法实现与荧光配体的结合（图12）。
图12 split-halotag技术的原理图以及对已知互作蛋白的检测结果(minner-meinen et al., 2021)。
ksp检测系统
雷帕霉素（rapamycin）能够介导hsfkbp12的fkbp结构域（fkbp）和mtor的fkbp12雷帕霉素结合结构域（frb）之间的异二聚化。其作用方式为雷帕霉素先与fkbp结构域结合形成复合体，再进一步与frb结构域结合。利用这一特性，科研人员率先在人类细胞中创建了用于研究蛋白功能的knocksideways系统（图13）(robinson et al., 2010)，并取得了许多研究成果。
图13 knocksideways系统工作原理(robinson et al., 2010)。在雷帕霉素的作用下，锚定**粒体上的frb融合蛋白与fkbp融合蛋白形成异二聚体，从而使ap复合体定位**粒体上。
2023年1月，winkler等人在the plant cell杂志上发表了题为“visualizing protein-protein interactions in plants by rapamycin-dependent delocalization”的研究**。在该**中，作者基于knocksideways系统，建立起了可应用于植物细胞中的ksp（knocksideways in plants）蛋白互作检测系统，该系统与传统的蛋白互作研究技术bifc相比，不再依赖于荧光基团的互补或基团之间的空间距离，并且可以在极短的时间内观察到稳定的结果。在ksp蛋白互作检测系统的创建过程中，作者首先将亚细胞定位信号、荧光蛋白与frb融合在一起，获得了多种不同亚细胞定位的frb融合蛋白。接着作者将亚细胞定位与frb融合蛋白不同的诱饵蛋白与fkbp蛋白连接，通过在烟草中共表达这两个融合蛋白，并施用雷帕霉素后，fkbp融合蛋白会重新定位在frb融合蛋白的细胞结构上（图14）。这一结果表明雷帕霉素在植物细胞中，也能够介导异二聚体的形成，说明ksp系统适用于植物细胞。
图14 雷帕霉素使fkbp融合蛋白重新定位在frb融合蛋白的细胞结构上(winkler et al., 2021)。未添加雷帕霉素（rap-）和添加雷帕霉素（rap+）的情况下瞬时表达mcherry-fkbp和tagbfp2-frb*融合蛋白在烟草叶片中的亚细胞定位情况。
确定ksp检测系统的可行性之后，作者利用mito-tagbfp2-frb*（定位**粒体上）在ksp检测系统中测试了sacl和lhw的相互作用。在没有添加雷帕霉素的条件下，sacl-gfp和lhw-mcherry-fkbp定位在细胞核上，使用雷帕霉素处理后，这两个融合蛋白离域到了线粒体，从而证实了这两个蛋白在ksp检测系统中的相互作用，这一结果也进一步验证了通过其它蛋白互作技术，如：免疫沉淀-串联质谱、酵母双杂得到的互作结果（图15）。
图15 ksp检测系统通过使融合蛋白离域到线粒体来对植物中的蛋白质-蛋白质相互作用进行定量可视化(winkler et al., 2021)。
小远叨叨
文章至此就告一段落了！在本期的推文中小远主要是给大家盘点了一下在植物中研究蛋白互作的方法及其应用案例（不是在植物中研究蛋白互作的方法，比如酵母双杂、gst pull-down等这里没有介绍），但是因为“split-halotag技术”和“ksp检测系统”是近两年才开发出来的新技术，因此小远没有找到特别合适的应用案例，大家如果对这两个技术感兴趣的话，可以查阅一下相关的资料，如果找到合适的案例欢迎给小远留言哦！另外总结不到位的地方也欢迎大家批评指正。最后，小远还想跟大家再简单聊一下上述实验方法的优缺点，方便大家选取合适的方法用于自己的实验。
1）bifc技术不仅可以直观、快速判断目标蛋白在活细胞中的定位和相互作用，还能用于体外的蛋白质相互作用。该技术对仪器的要求没那么高，且背景干净。但是它对温度敏感，无法实时观察分子间的相互作用，容易光漂白，且存在假阳性和假阴性问题，需要在实验中反复验证。
2）荧光素酶互补实验因其高灵敏度、可定量化、操作简单高效被广泛应用于植物学和动物学蛋白质互作研究。但是缺点也是存在假阳性，需要其它蛋白互作方法进一步验证。（3）co-ip是以抗体与抗原之间的专一性作用为基础来研究蛋白质相互作用的经典方法，也是确定两种蛋白在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。但是它无法确定两种蛋白质的结合是直接结合，且实验过程比较繁琐，对实验者的操作技术要求较高。（4）邻近标记技术不仅无需构建文库或使用抗体，还对疏水性和低丰度蛋白的互作蛋白鉴定以及弱/瞬时互作蛋白的分析具有独特的优势。但是邻近标记使用的酶大多数最适温度为37℃，而这一温度不利于大部分植物的生长，另外，生物素连接酶蛋白表达水平、外源生物素浓度以及孵育时间都需要优化。
5）fret-flim技术具备高时空分辨率，能够实时监测植物活细胞中蛋白质的动态，分析程序简单快速，结果不需要光谱矫正。但是需要目标蛋白高表达，另外激发光源可能会引起光漂白，该技术的成本相对比较高，当供体蛋白与受体蛋白空间结构较大时，容易导致fret发生效率低，易出现假阳性。
6）split-halotag技术因为tmr染料的稳定性，可以用于长时间扫描观察，并且split-halotag片段不具有内在亲合性，降低了假阳性。但是该技术的实验方案和操作相对复杂，对实验者的操作要求高。
7）ksp检测系统可以在极短的时间内观察到结果，且结果并不依赖荧光基团之间的互补或基团之间的空间距离，但是对于一些移动性强或具有多种亚细胞定位的蛋白来说，使用该技术效果不佳。
references
cui y, zhang x, yu m, et al. techniques for detecting protein-protein interactions in living cells: principles, limitations, and recent progress. sci china life sci. 2019, 62(5): 619-632.
förster t. energy migration and fluorescence. 1946. j biomed opt. 2012, 17(1): 011002.
gao m, he y, yin x, et al. ca2+ sensor-mediated ros sc**enging suppresses rice immunity and is exploited by a fungal effector. cell. 2021, 84(21): 5391-5404.
ishikawa h, meng f, kondo n, et al. generation of a dual-functional split-reporter protein for monitoring membrane fusion using self-associating split gfp. protein eng des sel. 2012, 25(12): 813-20.
lang c, schulze j, mendel rr, et al. halotag: a new versatile reporter gene system in plant cells. j exp bot. 2006, 57(12): 2985-92.
liu y, liu q, li x, et al. mderf114 enhances the resistance of apple roots to fusarium solani by regulating the transcription of mdprx63. plant physiol. 2023, 192(3): 2015-2029.
margineanu a, chan jj, kelly dj, et al. screening for protein-protein interactions using förster resonance energy transfer (fret) and fluorescence lifetime imaging microscopy (flim). sci rep. 2016, 6: 28186.
minner-meinen r, weber jn, albrecht a, et al. split-halotag imaging assay for sophisticated microscopy of protein-protein interactions in planta. plant commun. 2021, 2(5): 100212.
robinson ms, sahlender da, foster sd. rapid inactivation of proteins by rapamycin-induced rerouting to mitochondria. dev cell. 2010, 18(2): 324-31.
shang s, liu g, zhang s, et al. a fungal cfem-containing effector targets npr1 regulator nimin2 to suppress plant immunity. plant biotechnol j. 2023.
winkler j, mylle e, de meyer a, et al. visualizing protein-protein interactions in plants by rapamycin-dependent delocalization. plant cell. 2021, 33(4): 1101-1117.
xie y, wang y, yu x, et al. sh3p2, an sh3 domain-containing protein that interacts with both pib and **rpib, suppresses effector-triggered, pib-mediated immunity in rice. mol plant. 2022, 15(12): 1931-1946.
yang x., wen z., zhang d., et al. proximity labeling: an emerging tool for probing in planta molecular interactions. plant commun. 2020, 2(2): 100137.
zhang y., song g., lal n.k., et al. turboid-based proximity labeling reveals that ubr7 is a regulator of n nlr immune receptor-mediated immunity. nat commun. 2019, 10(1): 3252.
苏田， 韩笑， 刘华东。 邻近标记在蛋白质组学中的发展及应用。 中国生物化学与分子生物学报， 2020, 36(01): 36-41.
向上滑动查看更多文献。
你为什么会选择回避型？
你知道和什么样的人谈恋爱最痛苦 最折磨人吗？答案是回避型依恋的人，很多人说回避型依恋的人天生就不适合谈恋爱，因为他们自带的属性就是排斥亲密关系，看到这里，或许会让部分没做好准备人的知难而退，我无意加大回避型依恋的恐怖程度，可回避型也真不是那么好磨的，他总是有意无意给人营造一种疏离感，有时甚至还会挑剔...
植美人尖选择什么的医院？
植美人尖手术是一项复杂的植发手术，选择医院 地区 医生和手术类型都是非常重要的。以下是关于选择植美人尖手术的医院 地区 医生和手术类型的建议。一 选择医院。.医院信誉 选择一家信誉良好的医院非常重要。可以通过查阅医院的官方 咨询其他患者或寻求专业人士的建议了解医院的专业水平和口碑。.医院设施 优质的...
选择性粘贴，5个高级用法，你会么？
当你还在普通复制粘贴的时候，你同事已经用上了选择性粘贴，提升工作效率，告别加班，今天分享选择性粘贴的个高级用法，最后一个大部分人没用过。 快速行列转置。如下所示，左边的竖向数据，和右边的横向数据，我们需要相互转换。我们只需要复制数据，然后右键，选择性粘贴，勾选转置即可，如果原始数据中有公式，则需要勾...