#肿瘤#
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导读：抗体药物的研发是目前生物制药领域相对成熟、备受关注的主流方向之一。在2023年4月，fda批准了第100款抗体药——葛兰素史克（gsk）的pd-1抗体 dostarlimab，用于**dmmr**或晚期实体瘤患者。随后抗体药的数量持续增加。为解决抗体生产周期长、费用高的问题，有研究者设想使用mrna技术在人体内表达单克隆抗体，从而发挥生物学效应。
2023年，国内学者在journal of cancer发表文章：《intr**enous delivery of rna encoding anti-pd-1 human monoclonal antibody for treating intestinal cancer》，研究人员设计了编码pd-1单抗：帕博利珠单抗（可瑞达/keytruda，也称k药）的ivt-mrna，并使用lnp包封mrna，评估了帕博利珠单抗-mrna的体外功能特性和体内抗肿瘤活性。一、研究背景
1.1 mrna技术替代抗体药物2023年，fda批准了全球首个单抗药物：muromonab-cd3（一种免疫抑制剂，用于降低接受器官移植病人急性排斥反应）。直到8年后的2023年，fda才又批准了第二款单抗药物。从2023年开始，各种类型的抗体药物开发呈现井喷式发展。在2023年4月，nature综述报道，fda已获批100款抗体药物，现在每年获批的抗体类药物已经将近占 fda 每年获批新药的近五分之一。
抗体药物在慢性炎症、自身免疫性疾病和肿瘤等疾病的**领域的应用拥有非常广阔的前景，然而也存在诸多缺陷：
①抗体的大规模生产和质量监管过于复杂，需要针对每个独特的抗体序列设计全新的生产方案；
②抗体药物的临床前开发周期至少需要1-2年；
③在某些情况下，抗体很容易被体内的蛋白酶快速清除和降解，需要频繁注射药物，由此带来更高的医疗费用和更多的***
图1: fda批准的抗体药物概览。
随着mrna技术的日益成熟，越来越的科学家开始尝试利用mrna技术来在体内直接生产抗体药物。相比传统的抗体体外生产方式，mrna技术具有以下优点：
摆脱了传统抗体行业中哺乳动物细胞培养、纯化等复杂流程；
在体细胞中完成更接近人类需求的翻译后修饰，理论上会产生活性更好的蛋白；
相比传统抗体药物的静脉注射，采用lnp递送，可快速、准确地提高抗体发挥药效部位的药物浓度，实现更低的剂量、更高的疗效。
1.2 pd-1/pd-l1靶点介绍pd-1/pd-l1通路被视为促进肿瘤逃逸的重要机制。pd-1属于b7家族成员之一，是一种免疫检查点，主要表达于活化的t细胞上，配体为pd-l1/pd-l2。与肿瘤细胞表面的配体（pd-l1/pd-l2）结合后，pd-1会下调 tcr/cd28 信号传导，促进负向通路，从而抑制t 细胞活化。帕博利珠单抗是首批表现出临床抗肿瘤功效且安全性良好的pd-1单克隆抗体之一，并于 2014 年获得 fda 批准上市。据fda最新说明书，帕博利珠单抗的获批适应症包括18个癌种。二、编码单抗的mrna的设计与优化
研究人员设计了编码帕博利珠单抗的重链mrna和轻链mrna，分别由5'帽结构（5' cap'utr、信号肽（sp）、cds序列及poly a尾巴组成。其中5'utr和3'utr分别**于巨细胞病毒ie1和人生长激素基因的部分序列，poya尾巴长度为115nt。
在抗体信号肽序列的选择上，研究人员有3种候选序列，分别来自：人免疫球蛋白κ轻链（higlc）、白细胞介素10（il-10）、人 igg1 重链 (highc)。将编码3种不同信号肽序列的单抗重链/轻链 mrna进行配对，转染aml-12细胞，elisa检测细胞上清液中帕博利珠单抗的表达水平。结果发现，携带higlc信号肽的mrna能够表达出更高水平的单抗。在小鼠体内，单次注射携带三种不同信号肽的mrna-lnp（0.5 mg/kg ），含higlc信号肽的mrna产生的血清抗体水平也更高。因此，无论是从细胞水平，还是体内表达来看，选择人免疫球蛋白κ轻链（higlc）作为信号肽显然有利于增强mrna的翻译表达。
最后，在aml-12细胞水平和小鼠体内，探索了不同摩尔比的重链和轻链 (hc/lc) mrna对抗体表达的影响。结果发现，当hc-mrna与lc-mrna比例为0.6:1时，mrna翻译表达单抗的水平在细胞和小鼠体内可实现最大化。
图2：编码单抗的mrna的设计与优化三、编码单抗的mrna的验证试验
3.1 小鼠体内验证mrna的翻译表达向小鼠体内静脉注射。6和2 mg/kg剂量的mrna-lnp，可以明显观察到给药后血清中帕博利珠单抗水平呈现剂量效应。在直接注射重组型帕博利珠单抗（5mg/kg）后 0.25小时，血清帕博利珠单抗达到峰值，随后便急剧下降。相反，mrna-lnp（2.0mg/kg）给药后48h，血清帕博利珠单抗达到峰值，并且在单次注射后的 35 天内保持在 20 μg/ml 以上。
此外，向免疫缺陷小鼠每周一次静脉注射编码单抗的mrna-lnp（2.0 mg/kg），每次注射后都可以观察到几乎一致的单抗血清浓度-时间曲线，表明在小鼠体内持续注射 mrna 能够稳定、持续地表达抗体。
图3：mrna体内翻译产生单抗。
3.2 mrna翻译形成的单抗功能验证研究人员比较了cho 细胞**的重组型帕博利珠单抗和mrna技术体内翻译形成的帕博利珠单抗的功能差异性，主要涉及亲和力和结合特异性之间的差异，阻断pd-1 与pd-l1/l2结合能力的差异以及增强t细胞功能的差异。两种不同**的单抗与人抗原(hpd-1)结合亲和力相似（kd 分别为 0.25 nm 和 0.61 nm），对稳定表达hpd-1 的cho细胞的亲和力也相似（相似的ec50）。研究者还发现两种**的单抗均能有效抑制 hpd-1 和 pd-l1/l2 之间的结合，重组型帕博利珠单抗的 ic 50 极低，为 0.36/0.67 μg/ml，帕博利珠单抗-mrna 为 0.41/0.89 μg/ml。通过上述研究，采用mrna技术体内翻译形成的帕博利珠单抗与cho 细胞表达的重组型帕博利珠单抗具有相似的结合和阻断活性。
利用混合淋巴细胞反应 (mlr) 评估两种**的帕博利珠单抗的功能活性。用同种异体 cd4+t 细胞和dc细胞及两种**的帕博利珠单抗混合，发现mrna翻译生成的帕博利珠单抗和cho细胞**的重组型帕博利珠单抗均以浓度依赖性方式显着增加 t 细胞分泌的ifn-γ和il-2。
活化t细胞核因子(nuclear factor of activated tcell,nfat)是具有多向调节功能的转录因子，如调节t细胞的活化、分化及自身耐受性等。在荧光素酶报告系统中，两种**的帕博利珠单抗均可有效激活nfat 启动子。
图4：mrna翻译形成的单抗功能验证。
3.3 编码单抗的mrna抗肿瘤作用pd-l1 人源化mc38荷瘤小鼠静脉注射。6 和 2.0 mg/kg的mrna-lnp，使用 10 mg/kg的重组型帕博利珠单抗作为阳性对照，并记录肿瘤生长。结果显示所有 mrna-lnp **组的 tgi（肿瘤生长抑制因子）均显著增加，分别为 0.2 mg/kg.6 mg/kg（76%）和 2.0 mg/kg（91.5%），而重组型帕博利珠单抗组为70.1%。特别是，接受 2.0 mg/kg mrna-lnp **的 10 只小鼠中有 5 只肿瘤消失。每次注射后仅观察到轻微的体重减轻，然后在2天内体重又会迅速恢复。
为了评估**性免疫调节，研究者进一步研究了首次使用帕博利珠单抗-mrna-lnp **后 14 和 28 天后 cd4 + 和 cd8 + t 细胞的比率。流式细胞术分析结果显示，接受**的各组中cd4 + 和cd8 + t细胞的比例略有增加，而cd8/treg和cd8/cd4细胞的比例增加明显。
图5：编码单抗的mrna具有抗肿瘤作用。
四、小结这项研究首次证实编码pd-1抗体（帕博利珠单抗）的mrna-lnp可明显抑制小鼠体内实体瘤生长，而且，即便在最高剂量下（ 2.0 mg/kg）也没有观察到任何明显的毒性作用。cho**的重组型帕博利珠单抗与mrna-lnp翻译表达形成的帕博利珠单抗具有相似的结合和阻断活性及对t细胞活性的增强。但是，与cho**的重组型帕博利珠单抗相比，注射帕博利珠单抗-mrna-lnp到小鼠体内，拥有更高水平的血清帕博利珠单抗。这可能有两方面的原因：第一，mrna可以在肝细胞中持续表达至少72小时，使得mrna编码的抗体分阶段持续释放到血液循环中；第二，mrna在小鼠体内表达出来的是内源性抗体，可能是内源性翻译后修饰带来更好的稳定性。
参考文献 1] wu l, wang w, tian j, qi c, cai z, yan w, xuan s, shang a. intr**enous delivery of rna encoding anti-pd-1 human monoclonal antibody for treating intestinal cancer. j cancer. 2022 jan 1;13(2):579-588. doi: 10.7150/jca.63991.
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