研究背景
乳腺癌是世界上最常见的恶性肿瘤，其中三阴性乳腺癌(tnbc)是一种难以**的类型，由于缺乏靶向药物，目前化疗仍是tnbc**的主要手段。
虽然免疫**策略在**各种癌症方面已显示出令人鼓舞的结果，然而，tnbc细胞通过降低其免疫原性来逃避宿主免疫系统，而免疫原性降低了肿瘤内细胞毒性t淋巴细胞(ctl)的浸润，化疗有时可通过释放损伤相关的分子模式分子(damps)诱导免疫原性凋亡，增强肿瘤的免疫原性。然而，大多数化疗呈“无声死亡”过程，导致免疫反应微弱。
焦亡是细胞程序性死亡的一种促炎形式，它依赖于gasdermin n端蛋白形成的质膜孔，最终释放大量的细胞内容物并引起有效的免疫应答。例如，化疗通常通过上调caspase-3的表达来诱导肿瘤细胞凋亡。如果肿瘤细胞表达gsdme, caspase-3可以将gsdme裂解至gsdme-c(gsdme c-末端)和gsdme- n (gsdme n -末端)，使非炎性化疗诱导的细胞凋亡转化为炎性焦亡，激活抗肿瘤免疫。然而，gsdme在包括tnbc在内的许多癌症中被下调，即使在cle**ed caspase-3过表达后也能阻止细胞焦亡。
文献**
2023年5月，中山大学帅心涛课题组在《nano letters》期刊发表文章：nanodrug augmenting antitumor immunity for enhanced tnbc therapy via pyroptosis and cgas-sting activation。
该团队构建了一种新型纳米脂质体(gm@lr)，并利用其将表达gsdme的质粒和羰基锰(mnco)共同递送到tnbc细胞中。在h2o2存在下，mnco生成mn2+和一氧化碳(co)。co活化的caspase-3切割表达的gsdme，使凋亡转化为焦亡。此外，mn2+通过激活sting信号通路促进树突状细胞(dcs)的成熟。瘤内成熟树突状细胞比例增加，细胞毒性淋巴细胞大量浸润，引发强烈地免疫反应从而有效抑制肿瘤的生长。
mnco/pgsdme纳米载体的制备(gm@l)示意图。
纳米脂质体的特性
经测定表明gm@lr在h2o2存在下可以形成稳定的纳米复合物并生成co。co可触发凋亡通路，纳米药物内化后可诱导肿瘤细胞凋亡。
通过yoyo-1标记的pgsdme(绿色)来跟踪gm@lr通过4t1细胞的内在化，结果显示内化的gyoyo- 1m@lr纳米颗粒最初被转运到溶酶体，然后pgsdme被转运到细胞核(图1h和i)。由于mnco产生的co在细胞内的积累可以通过促进ros的生成来诱导细胞凋亡。因此作者通过clsm和流式细胞仪使用dcfh-da探针测量细胞内ros水平，gm@lr组处理后的细胞中ros相关荧光最强。
项目研究
装载mnco的纳米**(m@lr和gm@lr)导致4t1细胞活力降低(图2a)。gm@lr与m@lr相比也没有增加细胞死亡率，这表明添加pgsdme并不会导致额外的细胞毒性。在mnco纳米药物处理的4t1细胞中检测到活化的caspase-3(图2d)。此外，经gm@lr处理的细胞表现出典型的细胞焦亡迹象，即肿胀和细胞膜破裂(红色箭头表示)，gsdme- n蛋白表达显著增加。仅在gm@lr处理后的培养基中，乳酸脱氢酶(ldh)水平显著升高(图2g)，进一步证实了细胞发生了焦亡。随后分析了gm@lr**后hmgb1和atp水平均显著增加。
为了监测纳米药物对树突状细胞成熟的影响，将未成熟的骨髓**树突状细胞(bmdcs)与处理后的4t1细胞的上清液一起培养。gm@lr组成熟dc (cd80+/cd86+)的百分比显著增加(图2k)，mhc-ii表达也显著上调(图3l)，即表明dc成熟，抗原呈递能力增强。如图2m所示，装载mnco纳米药物的bmdcs (m@lr和gm@lr)中，stin**平下调，cgas和p-irf3水平明显上调，表明cgas-sting信号通路被激活。
以上得出，gm@lr诱导焦亡的4t1细胞释放大量内源性damps(hmgb1和atp)和上调crt，随着mn2+激活cgas-sting信号通路，成熟dcs的比例增加（图2n）。
当原位肿瘤生长到约50mm3时，用不同的制剂(pbs、g@lr、m@lr和gm@lr)处理小鼠，并根据肿瘤体积和重量评价其抗肿瘤活性。如图3f−h所示，使用gm@lr**对肿瘤生长的抑制最大，这与最长的生存期相吻合(图3i)。此外，gm@lr对ki67阳性细胞的抑制作用也最为明显(图3j)。进一步分析了gsdme-n在肿瘤组织中的表达。gsdme在装载pgsdme纳米药物的肿瘤中表达(g@lr和gm@lr)，而gsdme- n仅在gm@lr组中表达(图3k)。因此，gm@lr诱导的肿瘤焦亡导致damps暴露，可能导致更强的抗肿瘤作用。
为了进一步证实gm@lr的抗肿瘤作用是一种有效的免疫反应的结果，随后测量了不同组的肿瘤免疫微环境。如图4所示gm@lr组中成熟的tidc比例最高，对应的肿瘤内cd8+ t细胞比例也最高。其次，由于mn2+促进tidc的成熟，gm@lr诱导的焦亡在肿瘤部位引起了强烈的局部免疫反应，并转化为显著的肿瘤消退。通过建立了4t1肺转移模型来证实gm@lr还能激发抗肿瘤免疫记忆，有效地防止肿瘤转移。
肝转移是乳腺肿瘤常见的临床症状。作者建立了肝内转移瘤模型(图5a)。静脉注射gm@lr后，mri t1加权像(t1wi)增强信号检测到界限清楚的高信号肝内转移瘤(图5b)，提示gm@lr可以帮助mri监测转移。术后3天对肝内转移瘤小鼠进行**(图5c)，在gm@lr处理小鼠中检测到最低的荧光素酶信号，表明这种纳米药物有效地抑制了肝内转移性4t1肿瘤的生长。h&e染色也证实了gm@lr对肿瘤抑制最大，细胞凋亡显著(图5d)。同时，gm@lr**可显著延长了荷瘤小鼠的生存时间(图5e)，cd80+cd86+成熟dc在转移瘤中的比例增加，肿瘤浸润性cd8+ t细胞增加(图5f,g)，瘤内treg减少(图5h,i)。总而言之，gm@ lr通过增强免疫反应对肝内转移瘤产生明显的抑制作用。
综上所述，该课题开发了一种peg-crgd修饰脂质体，包封mnco和pgsdme，用于靶向**tnbc。
peg-crgd表面修饰不仅提高了其稳定性，而且增强了其靶向肿瘤的能力。在内源性高水平h2o2存在的4t1细胞中，被包裹的mnco分解为mn2+和co，导致caspase-3激活。活化的caspase-3裂解全长gsdme诱导细胞凋亡，最终释放出大量的damps。此外，mn2+通过激活tidc中的cgas-sting通路增强了凋亡触发的抗肿瘤反应。这些协同作用显著抑制了原位和肝内转移性乳腺肿瘤的生长。
本研究提供了一种可能的策略，通过焦亡和cgas-sting信号激活诱导抗肿瘤反应，同时结合免疫**和mri诊断。
本实验中所用gsdme过表达质粒均由吉满生物构建。
文献原文
原文引用
gsdme plasmid and gfp plasmid were established by
genomeditech (shanghai, china)co.,ltd (shanghai, china).the mouse gsdme plasmid(gene id: nm_018769.4) was established by genomeditech (shanghai) with the vector pcdna3.1(+)
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