细胞铺板大概是细胞实验中最常见又必须掌握的一门技术，看起来是非常简单的一项操作，但其实也不是那么好做的，有很多人不是很得要领，经常会遇到细胞中间密或者中间稀疏等「细胞分布不均匀」的情况。
如下图为：细胞铺板时，常出现的细胞分布不均匀现象。
***于网络）
铺板成功的关键在于对细胞消化和铺板方法的正确拿捏和掌握。
1）细胞一定要消化好；
2）铺板前要混匀，把存在的细胞团尽可能分开。
细胞铺板实验
主要分为3大步骤：收集细胞→细胞计数→细胞铺板。
一、收集细胞，制作单细胞悬液。
贴壁细胞需要将细胞消化收集，消化后的细胞一定要充分混匀，要把聚在一起的细胞团充分地吹打开，最好是单个的状态，但同时又不能损伤细胞。
tips：消化细胞需要选择适用的消化液、适当的消化温度和时间。建议新手或者养的是一个新细胞时，自己要观察最佳胰酶消化时间及浓度。
消化后需要轻轻拍打细胞贴壁面，震落细胞。
一般用1000rpm/min离心即可，离心力太大细胞容易抱团！
离心后，要充分悬浮！悬浮离心后的细胞团时，先不要把所有液体都加进去！一般先加2ml液体，然后用1ml移液器轻轻将细胞吹起（注意不要有气泡），细胞要像云雾一样散开，这样易于形成单细胞。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力，所以要熟练操作，尽快上板。
二、细胞计数。
取10 微升加4%台盼蓝计数活细胞。
三、细胞接种。
需要根据实验目的选择不同规格的培养板。如在进行药物对待测细胞半抑制率（ic50）测试时，通常使用96孔板，一方面可以设置浓度梯度；另外还可一次性测多个药物，减少实验误差。
稀释细胞：根据细胞计数结果后，将细胞稀释到目的浓度。
获得细胞悬液后要先根据选择的培养板的种类，以及要种的细胞密度调整细胞悬液的浓度，可在离心管中调整后反复颠倒摇匀，种板需要一步完成，切不可先加细胞后补液或先加液再补细胞。
tips：细胞密度对于铺板很重要，过密很容易造成细胞居中，细胞浓度过稀会造成细胞难以生长起来。一般会在实验前进行预实验。
加入细胞悬液。
1）铺6孔板，12孔板或24孔板。
为防止表面张力导致的中间液面太低细胞聚集的现象，通常在每一个孔加少量的无血清培养基，不用太多，浸润孔底即可。一般可加一个孔，浸润，再用移液枪移取，再加入第二个孔，浸润，依此类推。
如果培养液量少，由于瓶体内液体有向边缘吸的特性，所以造成中间低洼，细胞容易聚集，可以多加点液体缓解。
然后加入细胞悬液，从孔的左边靠近底部贴壁慢慢加入，这样加液后，细胞悬液会平铺在整个孔底，细胞分散较均匀，可以避免加在中间位置和加在周边晃匀后周边细胞局部太多的现象。
细胞悬液加完后，将细胞培养板抬高，对着灯光，从底部往上看，看细胞有没有抱团。如果有抱团的话，用手指从底部轻轻敲打，使之分散。也可以用平板振荡器稍稍振荡一下。
接下来，将板放在水平板面上“十字”形摇匀（上下左右四个方向进行移动，呈十字形状，重复5-6次）。
不可以转圈摇，会导致细胞被带到中间。
摇匀后要放工作台静置一下，等细胞贴壁了，轻轻移入到培养箱中。
2）铺96孔板。
可用排枪，速度非常快。每孔加入100微升细胞悬液，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快容易导致细胞聚集）。加完半边板48孔后，将剩下的未加的细胞悬液再混一下，再继续加剩余的半边板子。
加完所有的时候，盖上盖子，左手轻轻扶住板的左边，右手轻轻敲击板的右边缘，注意把握力度，敲三次即可，太大力或次数太多会导致细胞集中成堆。将板顺时针旋转（逆时针效果不好），依次敲击剩余三个边，然后静置约5min，放置培养箱。
tips： 用排枪吸取时，一定要保证每个枪头吸上来的悬液体积一致。
如果是用于进行mts等长时间测试时，最外圈应空余出来（中间60孔为最佳，四周的一圈边缘孔不接细胞），加入pbs或细胞悬液（做空白或阴性对照），以防止培养基蒸发引起的边缘效应。培养箱里面或者外面尽量不要放可以产生振动的仪器，比如蠕动泵、离心机、涡旋器一类的仪器。这些仪器产生的振动对细胞贴壁有影响，也可能会导致细胞贴壁不均匀。
（1）细胞铺板后，细胞状态不好，可考虑以下几个原因：
用来铺板的细胞状态不好。②用来铺板的细胞传代次数太多，有些老化。③胰酶消化时间过长。④中和的血清量及时间不够。⑤支原体污染。
（2）细胞铺板不匀常见原因
消化过度，导致细胞结团率太高。
细胞状态差时，按照正常时间进行消化时，很容易造成细胞消化过度、细胞整片粘连在一起及结团率过高。这种情况任凭怎么吹打，后期细胞也很难吹打分散！
细胞吹打次数不够，细胞悬液密度不均匀。
吹打次数不够，容易导致细胞分散局部不均匀，细胞接种必然也是以失败告终；吹打次数过多，容易导致细胞存活率下降，对细胞凋亡、周期等考察细胞增殖的相关实验，会产生明显的偏差。
细胞吹打次数建议：不同细胞“皮实”程度不同，建议大家接种前做梯度吹打实验，细胞最小伤害的情况下去接种细胞。
铺板加样方法错误。
加样方式为倾斜枪头，从孔的左边靠近底部缓慢加入（加样过快同样容易导致细胞聚集）。
（3）如何避免每个孔之间的细胞量不一致？
铺板时，细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来而导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就再混匀一下。
铺板速度尽量快点，在加完半边板后，需要再次将培养皿内剩余的细胞悬液充分混匀再继续铺板。
（4）对于某些容易聚团的细胞，该怎么办？
对于容易聚团的细胞，尽管当时摇匀了，但是静置30min后，取出后将细胞培养板后，肉眼即可见严重的细胞居中抱团现象。
对于这种细胞的铺板，若是时间允许的话，可以降低接种密度，隔一天等细胞多了再进行药物处理或者划线等。
（5）为什么要贴侧壁加入细胞悬浮液？
因为接种之前已将细胞悬液做过充分混匀，直接从侧壁加入能尽量保持细胞悬液的均匀状态；另外贴侧壁加入也能减少孔内气泡的产生。
#细胞培养#
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