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文章介绍
2023年10月20日，日本学者在期刊iscience（if:5.8000）发表了一篇题为“cryptotanshinone is a candidate therapeutic agent for interstitial lung disease associated with a brichos-domain mutation of sftpc”的文章。
亮点
建立了针对 sftpc 突变的表型筛选系统。
将源自 ild 患者的 ipsc 用于评估候选化合物。
隐丹参酮抑制了sftpc突变导致的细胞死亡。
隐丹参酮可改善患者源 ipsc 的纤维化表型。
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摘要。abstract
间质性肺病（ild）代表一大类以肺部慢性炎症和纤维化为特征的疾病，其**选择有限。在常染色体显性遗传的家族性ild的几个致病基因中， sftpc的brichos结构域的突变通过其前蛋白的错误折叠导致蛋白质积累和内质网应激。通过使用 hek293 细胞中这两种表型的筛选系统以及使用从患者**的诱导多能干细胞 (ipsc) 分化的肺泡上皮 2 型 (at2) 细胞进行的评估，我们确定隐丹参酮 (cpt) 是 ild 的潜在**剂。cpt 减少了 a549 和 hek293 细胞中突变型 sftpc 过表达诱导的细胞死亡，并改善了源自具有 sftpc 突变的 ipsc 的成纤维细胞依赖性肺泡类器官中博来霉素诱导的基质收缩。cpt 和这种筛查策略可应用于异常蛋白质折叠相关的 ild 和其他蛋白质错误折叠疾病。
图形摘要。#
研究方法。methods
1. 图像分析。
2. 实时荧光定量pcr
3. rt-pcr产物的序列分析。
4. 西方印迹。
5. 免疫细胞化学。
6. hibit测定。
7. 患者**的ips细胞的生成和维护。
8. spc y104h基因编辑ipsc
9. 患者**的ips细胞分化为at2细胞。
10. 人类胎肺成纤维细胞的培养和ips细胞衍生的at2细胞在fd-aos中的维护。
11. 从fd-aos中分离上皮细胞和成纤维细胞。
12. rna测序和数据分析。
13. 基因集富集分析。
14. blm和化合物在fd-aos中的处理。
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主要结果。results
高通量筛选和鉴定可降低突变 sftpc 引起的 er 压力的化合物
对初筛中发现的化合物进行二次筛选
利用源自患者的 ipsc 分化出的肺泡上皮细胞进行化合物疗效评估
cpt 可减少 y104h sftpc 造成的聚集和细胞死亡
cpt可改善由spcy104h-ipsc衍生的肺泡类器官的疾病表型
图1 高通量筛选和鉴定可降低突变 sftpc 引起的 er 应激的化合物。
a) xbp1-hibit reporter 的构建示意图。它在 er 压力下剪接并翻译成剪接后的 xbp1（外显子 4）-hibit 融合蛋白。stop 符号表示未剪接 mrna 开放阅读框的终止密码子。
b) 使用 nano-glo hibit lytic detection system 对转染了 xbp1-hibit reporter 并用曲纳霉素。5 或 5.0 μg/ml）或 dmso（0.05%）处理 6 小时的 hek293 细胞进行细胞 hibit 检测（n = 6）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.001 [单因子方差分析（anova）与 tukey 多重比较检验]。
c) 筛选方法示意图。
d) 使用细胞 hibit 检测法验证高通量筛选。用 xbp1-hibit reporter 和空载体或 l188q 突变 sftpc 表达载体（l188q sftpc）共转染 hek293 细胞，n = 80（l188q sftpc），n = 12（空载体）。
e）rt-qpcr 检测用共转染的 xbp1-hibit reporter 和野生或 l188q sftpc 表达载体培养 24 小时的 hek293 细胞中 xbp1-hibit reporter 的剪接比率（剪接/总表达）。数据以平均值 ± sd 表示（n = 3 个独立实验）。∗p < 0.01（韦尔奇 t 检验）。
f) 在筛选 2480 种化合物时，xbp1-hibit reporter 与 l188q sftpc 表达载体共转染分析的相对发光单位（rlu）（dmso 的百分比）散点图。数据以平均值表示（n = 2）。
g) 散点图显示了在筛选 2480 种化合物时，wst-8 检测结果（n = 2）（dmso 百分比）与 hibit 检测结果（来自图 1f）的成对比较。红色和蓝色字符和线条表示识别命中化合物的各个阈值。另见图 s1。
图2 对初筛中发现的化合物进行二次筛选。
a) 用共转染的 xbp1-hibit reporter 和野生或 y104h sftpc 表达载体孵育 24 小时的 hek293 细胞中，xbp1-hibit reporter 的剪接比率（剪接/总表达）的 rt-qpcr 检测。数据以平均值 ± sd 表示（n = 3 个独立实验）。∗p < 0.001（学生 t 检验）。
b 和 c）转染 acgfp-wild sftpc 或 acgfp-y104h sftpc 的 hek293 细胞的光斑强度（b）和总光斑面积（c）的平均值（n = 4，每个样本为 81 视场 × 3 孔的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.001（学生 t 检验）。
d) 转染 acgfp-wild sftpc 或 acgfp-y104h sftpc 的 hek293 细胞的代表性显微图像。细胞核由 hoechst 33342（蓝色）显现。缩放条 = 100 μm。
e) 使用细胞 hibit 检测法验证筛选结果。用 xbp1-hibit reporter 和空载体或 y104h 突变的 sftpc 表达载体（y104h sftpc）共转染 hek293 细胞，n = 80（y104h sftpc），n = 12（空载体）。
f) 散点图显示了用 acgfp-y104h sftpc 转染 hek293 细胞的斑点强度（占 dmso 的百分比）平均值（数据以 n = 2 的平均值表示，每个样本取 81 个视场的平均值）与用 y104h sftpc 共转染的 xbp1-hibit reporter 分析的 rlu（占 dmso 的百分比）平均值（n = 2）的成对比较结果。红点表示通过筛选的化合物。
g)通过 rt-qpcr，在 hek293 细胞中分析 xbp1-hibit reporter 的剪接比率（剪接/总表达），将共转染 xbp1-hibit reporter 和 y104h sftpc 表达载体的 hek293 细胞培养 4 小时，然后用 9 种化合物中的每一种以指定浓度处理 24 小时（n = 2）。数据以平均值 ± sd 表示。红点表示通过筛选的化合物。红线为 fc = 0.75。另见图 s1。
图3 利用源自患者的 ipsc 分化出的肺泡上皮细胞对化合物进行疗效评估。
a) 患者** ipsc（spcy104h-ipsc）及其同源对照野生型 sftpc 单倍表达 ipsc（maespcy104h-ipsc）的生成和逐步分化为含有 at2 细胞的肺泡上皮细胞的示意图概览。
b）spcy104h-和maespcy104h-ipsc诱导分化成at2细胞6天后，sftpc mrna的rt-pcr产物序列分析。红色箭头表示 y104h 突变（c.310t>c）的位置。
c）spcy104h ipsc 和 maespcy104h-ipsc 核型的 g 带分析。
d和e）免疫荧光分析，量化spcy104h-iat2（d）和maespcy104h-iat2（e）细胞中sftpc的积累。每种条件下的 iat2 细胞在分化 7 天后用指定化合物处理 48 小时。对 sftpc 染色高强度区域的荧光信号强度进行量化并按荧光面积归一化。数据以平均值 ± sd 表示（n = 3 个独立实验）。∗p < 0.05（学生或韦尔奇 t 检验，与 dmso 比较）。
f) 基于图 3d 和 3e 结果的 spcy104h-iat2 和 maespcy104h-iat2 细胞与 cpt 处理的比较分析。∗p＜0.05，∗∗p＜0.01（学生或韦尔奇 t 检验，与 dmso 处理的 spcy104h-iat2 比较）。
g）用 cpt 处理 spcy104h-iat2 和 maespcy104h-iat2 细胞 48 h 后，sftpc（绿色）免疫染色和 hoechst 33342（蓝色）核染色的代表性图像。缩放条 = 100 μm。
h）隐丹参酮（cpt）的结构，化合物编号 #2035。另见图 s2 和表 s1。
图4 cpt 可减少 y104h sftpc 引起的聚集和细胞死亡。
a和b）分析了转染acgfp-wild sftpc或acgfp-y104h sftpc 48小时的a549细胞中每个细胞的acgfp斑点强度（a）和每个细胞的acgfp斑点总面积（b）的平均值（n = 3，每个样本取81个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.001（学生 t 检验）。
c) 用 acgfp-y104h sftpc 转染 a549 细胞 4 小时，然后用 cpt.5 或 5 μm）或 dmso（0.1%）处理 48 小时的斑点强度和斑点总面积分析（n = 3，每个样本取 81 个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗与 dmso 对照组相比，∗p < 0.05，∗∗p < 0.01，∗∗p < 0.001（单因素方差分析与 tukey's 多重比较检验）。
d) 用 acgfp-y104h sftpc 转染 a549 细胞 4 小时，随后用 cpt（2.5 μm）或 dmso（0.1%）处理 48 小时的代表性图像。缩放条 = 50 μm。
e）使用抗 sftpc 抗体对转染 acgfp-wild sftpc 或 acgfp-y104h sftpc 4 h 并随后用 cpt.5 或 5 μm）或 dmso（0.1%）处理 48 h 的 a549 细胞进行 wb 检测的代表性结果。使用密度计量化信号强度（右图）。进行了三次独立实验，数据以平均值 ± sd 表示。∗p < 0.05（学生 t 检验，与 dmso 对照组比较）。
f) a549 细胞转染 acgfp-wild sftpc 或 acgfp-y104h sftpc 24 小时后，活化的 caspase-3 和 sftpc-gfp 双阳性细胞的数量，并对 gfp 阳性细胞数量进行归一化计算（n = 3，每个样本取 169 个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.01（学生 t 检验）。
g) a549 细胞转染 acgfp-y104h sftpc（左图）或 acgfp-wild sftpc（右图）4 小时后，用 1.25 μm cpt 或 dmso（0.1%）处理 24 小时，活化的 caspase-3 和 sftpc-gfp 双阳性细胞的数量，并对总细胞数进行归一化计算（n = 3，每个样本取 169 个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗p < 0.05（学生 t 检验）。
h）转染 acgfp-wild sftpc 或 acgfp-y104h sftpc 24 小时的 hek293 细胞中活化的 caspase-3 和 sftpc-gfp 双阳性细胞的数量，并通过归一化 gfp 阳性细胞的数量进行计算（n = 3，每个样本取 169 个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.001（学生 t 检验）。
i) hek293 细胞转染 acgfp-y104h sftpc（左图）或 acgfp-wild sftpc（右图）4 h 后，用 2.5 μm cpt 或 dmso（0.1%）处理 24 h，活化的 caspase-3 和 sftpc-gfp 双阳性细胞的数量，并对总细胞数进行归一化计算（n = 3，每个样本取 169 个视野的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.001（学生 t 检验）。另见图 s3。
图5 鉴定由 spcy104h ipsc 生成的 fd-aos 及其在 blm 诱导的收缩试验中的应用，以验证 cpt 的疗效。
a) 成纤维细胞依赖性肺泡类器官（fd-aos）的生成和 rna-seq 分析示意图。
b) 根据 deseq2 分析结果生成的火山图。左图：spcy104h-aec vs. maespcy104h-aec，右图：spcy104h-fib vs. maespcy104h-fib（分别为 n = 3 个独立实验）。aec 和 fib 分别从源自 ipsc 的 fd-aos 中分离出来。红色字符表示明显上调基因的数量，蓝色字符表示明显下调基因的数量。
c) spcy104h-aec 和 maespcy104h-aec 中 "wp lung fibrosis "基因组基因表达数据的 gsea 富集图。nes：归一化富集得分；nom：标称；fdr：错误发现率。
d) fd-aos 的生成及其在博莱霉素（blm）诱导的肺纤维化模型中的应用示意图，以分析 cpt 的疗效。
e）第 17 天培养基质的代表性全孔成像。从第 11 天到第 14 天，每孔都用 blm、blm 和 10 μm cpt 或 dmso 处理；从第 14 天到第 17 天，每孔都用 10 μm cpt 或 dmso 处理。比例尺为 2 毫米。
f) 量化第 17 天基质面积的变化（第 14 天的百分比，n = 3 个独立实验，每个样本取三个孔的平均值）。数据以平均值 ± sd 表示。∗∗p < 0.01（单因素方差分析，tukey 多重比较检验）。另见图 s4 和表 s2。
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总结。suggestion
本文的研究结果表明，化合物hil-1可以通过促进at2细胞增殖和减少成纤维细胞增殖来改善间质性肺疾病（ild）的病理表现。此外，研究还发现，hil-1可以通过调节多种信号通路来发挥作用，包括抑制tgf-β信号通路、激活wnt信号通路和抑制nf-κb信号通路等。 这些发现对于ild的**具有重要的意义。目前，ild的**方法非常有限，且效果不佳。本文的研究为ild的**提供了新的思路和方法，为开发新的**药物提供了重要的参考。此外，本文的研究方法也为研究其他肺部疾病的**提供了借鉴和启示。
参考信息。cryptotanshinone is a candidate therapeutic agent for interstitial lung disease associated with a brichos-domain mutation of sftpc.iscience. 2023 aug 25;26(10):107731. doi: 10.1016/j.isci.2023.107731.pmid: 37701577 pmcid: pmc10494175.
本文**：类器官学社
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