葉綠體普遍存在於植物體中，葉綠體基因組是乙個典型的雙鏈環狀dna分子，乙個植物當中含有多個葉綠體，乙個葉綠體中含有12個cpdna分子。
常見的植物葉綠體基因組大小一般在150-160 kb左右，藻類會略小一些，在80-100 kb左右，一般由四部分組成，包括乙個lsc和乙個ssc，以及二者之間的兩個ir區。隨著高通量測序技術的快速發展，利用葉綠體來研究細胞器的起源、結構、進化正受到越來越廣泛的關注。
圖1 具有代表性的金腰屬葉綠體基因**譜
凌恩生物負責對每乙個樣本的葉綠體dna（cpdna）進行富集及抽提，有自主研發的細胞器提取技術，提取經驗豐富。有專業團隊負責跟進每乙個專案，從細胞器dna製備、hiseq建庫及測序、後續生物資訊分析，直至為客戶提供滿意的結果。
本期主要介紹葉綠體基因組的一些高階分析內容。
共線性分析
共線性是指遺傳學中的基因連鎖關係，是不同物種染色體上同源基因以相同順序排列的現象。兩個物種之間的共線性程度可以作為衡量他們之間進化距離的尺度，可以知道物種間的親緣關係。對基因組間的區域性共線性塊進行相似度、重排、倒置等現象的分析可以來闡述物種演化中發生的事件。
圖2 葉綠體基因組mvista共線性分析系統進化樹分析
系統發育樹（phylogenetic tree）又稱為系統進化樹，是用一種類似樹狀分支的圖形來概括各物種之間的親緣關係，可用來描述物種之間的進化關係。通過系統進化樹分析可以找出不同物種間的進化關係，理解祖先序列與其後代之間的關係，同時也可以估算一組共有共同祖先的物種間的分歧時間。
細胞器基因組非常保守，常用來構建系統發育進化樹來研究動植物的物種分類和進化地位。凌恩生物構建細胞器系統發生樹的方法有以下兩種：
1）基於樣品與參考基因組的群體snp矩陣構建進化樹：對於每乙個樣本，按照相同順序將所有snp相連，獲得相同長度的fasta格式的序列（其中乙個為參考序列），作為輸入檔案用於進化樹構建。（2）基於core基因構建進化樹：對細胞器基因組鑑定出來的單拷貝core基因，利用muscle v3.8.31軟體進行蛋白多序列的比對，比對結果用於進化樹構建。
圖3 基於cppcgs+nrdna矩陣的金腰屬系統發育樹[1]選擇壓力分析
選擇壓力是指外界施加給某物種生物進化過程中的壓力，使得物種適應自然環境。在遺傳學中，ω=ka/ks或者dn/ds表示的是非同義突變（ka）和同義突變（ks）之間的比率。一般認為，同義突變不受自然選擇，而非同義突變則受到自然選擇作用。通常認為，ω 1表明有正選擇（positive selection）效應，即有些有利突變正受到選擇；ω 1不受選擇，即中性進化（neutral evolution）；如果0 < 1，則認為有純化選擇（negative or purifying selection）作用，ω值越小，說明受到的負選擇壓越大，氨基酸序列越保守。
圖4 金腰屬的選擇壓力分析[1]葉綠體基因組的ir區擴張與收縮
葉綠體基因組ir區指的是葉綠體基因組中2個反向重複區域（irs）。葉綠體基因組的ir區域被認為是最保守的區域，但其邊界區序列可能會向外延伸擴張，也可能向內部收縮，從而導致相關基因拷貝數的變化，或者導致邊界區域假基因的產生，這是葉綠體基因組進化中的共有現象，也是其長度變異的主因。
通過ir區的擴張與收縮研究，可以獲悉導致相關基因拷貝數的變化，或者導致邊界區域假基因的產生，以此來描述造成不同譜系間葉綠體基因組大小差異的原因。
圖5 ir區的擴張與收縮[2]結構變異檢測
細胞器基因組進行結構變異檢測主要有三種：snp、indel和sv。與參考基因組比對，分析近源物種細胞器基因組之間的變異情況，能夠更好的對個體或群體進行差異性分析。
snp（單核苷酸多型性）是指由單個核苷酸的變異所引起的dna序列多型性。在基因組dna中，任何鹼基均有可能發生變異，因此snp既有可能在編碼基因內，也有可能在非編碼序列上，位於編碼區內的snp（coding snp，csnp）因其可能影響個體的功能而備受關注。
indel是dna序列的插入（insertion）和缺失（deletion）現象的總稱，狹義的indel表示1~10bp的短indel。在基因組編碼區域，indel的發生可能會引起移碼突變、氨基酸改變、假基因的出現等等現象。這裡分析的是狹義的indel。
基因組結構變異（sv，structural variation）通常是指基因組內dn**段缺失、插入、重複、倒位、異位。使用mummer軟體對目標基因組和參考基因組進行比對，再使用lastz對區域間進行比對，從區域比對結果中查詢sv。
圖6 全基因組結構變異型別配對圖核苷酸多型性（pi）分析
核苷酸多型性（pi）是衡量特定群體多型性高低的引數，是指在同一群體中隨機挑選的兩條dna序列在各個核首酸位點上核昔酸差異的均值。核苷酸多型性（pi）能揭示不同物種核酸序列的變異大小，變異度較高的區域可以為種群遺傳學提供潛在的分子標記。例：基因和基因間區的核苷酸多樣性分析。
圖7 44個金腰屬物種cp基因組的核苷酸多樣性（pi）分析[1]共有基因和特有基因分析
所有樣本中都存在的同源基因稱為「共有基因」（core gene），去掉共有基因後得到的為非共有基因（dispensable gene），特有基因（specific gene）為只有該樣本特異擁有的基因。共有基因和特有基因很有可能與樣品的共性和特性相對應，可以作為樣本間功能差異的研究依據。
圖8 core-pan基因稀釋曲線
圖9 基因組的共有/特有基因數密碼子偏好性分析
某一特定密碼子在編碼對應氨基酸的同義密碼子中的相對概率，可以反應密碼子的偏好性程度。通過計算relative synonymous codon usage（rscu）獲得密碼子的偏好性值。研究密碼子的使用模式，對於探明物種進化壓力以及進一步的遺傳研究都有重要的意義。
圖10 烏頭屬物種密碼子偏好性分析[3]簡單重複序列ssr分析
簡單重複序列（**sequence repeat, ssr）又稱作微衛星序列（microsatellite, ms），是一類由1-6個核苷酸為基本單位多次重複而形成的dn**段。ssr數量豐富、多型性高、均勻覆蓋整個基因組、呈共顯性遺傳且檢測簡單，因此被作為第二代分子標記廣泛應用於遺傳圖譜構建、目標基因定位、遺傳多樣性研究、分子輔助育種、種質資源鑑定等領域。
圖11 薑科植物葉綠體基因組的簡單序列重複序列（ssr）分析[3]重複序列分析
重複序列被認為在基因組重組和重排中起重要作用，並且在某些群體中也包含有系統發育資訊。葉綠體基因組的重複序列包括串聯和散在重複，其中散在重複又稱為長重複序列，分為：正向重複（forward repeat）、反向重複（reverse repeat）、回文重複（palindromic repeat）和互補重複（complement repeat）四種型別。
圖12 長重復序列分類圖
參考文獻。1] a comprehensive analysis of chloroplast genome provides new insights into the evolution of the genus chrysosplenium. international journal of molecular sciences, 2023.[2] complete chloroplast genomes provide insights into evolution and phylogeny of zingiber (zingiberaceae). bmc genomics, 2023.[3] comparative analysis of the chloroplast genome for aconitum species: genome structure and phylogenetic relationships. frontiers in genetics, 2022.
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